細胞培養の日常的な観察方法と注意事項
細胞培養の日常的な観察方法と注意事項
細胞が接種または継代培養された後、実験者は毎日、またはせいぜい 1 ~ 2 日間、細胞の日常的な検査を行う必要があります。細胞の形態や増殖、培養液のpH変化、汚染の有無などを観察します。細胞の動的な変化に応じて、補液や継代処理を行います。異常が発見された場合は、速やかに対策を講じてください。
1. 形態学的な成長状態が良好な細胞は、一般的な顕微鏡で見ることができ、透明度が高く、屈折が強く、輪郭が不明瞭です。細胞の増殖が不十分になると、輪郭が強調され、細胞質に液胞や脂肪滴などの粒子が現れることが多く、細胞間のギャップが拡大し、細胞の形態が不規則になるか、上皮細胞が上皮のようになるなど、本来の特徴を失うことさえあります。細胞。細胞が死ぬと、一部の色素が変性した細胞膜を介して崩壊した核 DNA と結合し、細胞を着色することがあります。したがって、トリパン ブルーは、死んだ細胞と生きている細胞を識別するためによく使用されます。生きている細胞は染色されず、死んだ核は青色です。
2.初代培養または継代培養細胞懸濁液の接種後の細胞増殖は、異なるインキュベーション期間後に増殖し始めました。継代細胞株、胚組織、または幼虫組織は、通常、翌日に細胞の成長が見られ、1 週間以内に断片に接続できます。接種した細胞がボトルの壁全体に増殖したら、時間内に再培養する必要があります。そうしないと、栄養の消費と代謝の蓄積により、細胞は停止または分解期に入ります。このとき、細胞の輪郭が強調され、細胞内に顆粒状の沈着物が出現することが多く、これがミトコンドリアの腫れです。細胞質が空胞化し、細胞が丸く粗くなる。深刻なケースでは、細胞がボトルの壁から落ちます。適時に継代培養することによってのみ、細胞は成長と再生を続けることができます。
3.通常の状態では、養液はピーチレッドです。細胞をpH6.5～6.6に保つと、細胞が脱落して死んでしまいます。培養液が酸性化して黄色に変わったら、培養液中の代謝物が一定量蓄積したことを示しており、新鮮な培養液を交換する必要があります。HEPES を培地に添加するか、5%co2 インキュベーターで培養すると、pH は比較的安定に保たれます。栄養溶液を交換する時間は、栄養素の消費によって異なります。細胞の生育が旺盛な場合は2~3日、生育が遅い場合は3~4日で交換できます。細胞によって pH 値の要件が異なることに特に注意する必要があります。
4. 微生物汚染 培養細胞培養の微生物汚染の後、pH 値が変化し、培養液が濁って見えます。細菌感染後、細菌の移動により、光学顕微鏡下でわずかな閃光が見られます。真菌感染症では、多くの糸状菌糸と、時にはクラスター化した胞子が顕微鏡下で見られました。マイコプラズマ汚染は、いくつかの検出方法によってのみ検出できます。細胞が汚染された後は、通常は廃棄する必要があります。重要な細胞株については、関連するモノグラフを参照して、汚染を除去するためのいくつかの対策を紹介できます。重要な実験や貴重な細胞は、少なくとも 2 人の実験者が独立して、または 1 人で複数回 (時間をずらして) 培養および操作する必要があります。培養実験室の衛生状態に加えて、空気中の湿度は微生物汚染と密接に関係しています。長期にわたる重要な実験は、空気の湿度が低い秋と冬に行う必要があります。
その他の注意事項：
まず、頻繁に観察して細胞の状態を判断します。
第二に、抗生物質を追加するかどうか。これは状況によって異なります。細胞培養の過程では、無関係な不純物をできるだけ添加しないことが必要です。抗生物質も細胞の負担です。
第三に、ウシ胎児血清の解凍。通常、血清は-20℃で保存し、4℃の冷蔵庫で解凍しますが、解凍には時間がかかり、1日前に解凍する必要があります。